Media Eosin Methylene Blue Agar (EMB)

SEJARAH MEDIA EOSIN METHYLENE BLUE AGAR 

Media Eosin Methylene Blue Agar  adalah hasil modifikasi dari Levine M. (1918-1921) yang digunakan untuk diferensiasi Escherichia coli dan Enterobacteria aerogenes, untuk identifikasi cepat dari Candida albicans, dan untuk identifikasi Staphylococcus koagulase-positif. Media yang sudah jadi dirumuskan secara spesifik oleh APHA (American Public Health Association) (1970-1992). Media ini dibuat dan dirumuskan dengan tujuan untuk mendeteksi dan membedakan mikroorganisme dari kelompok bakteri coliform.

Weld  Julia (1951-1953) mengusulkan penggunaan media  Levine Eosin methylene blue agar, dengan menambahkan chlortetracycline hydrochloride untuk identifikasi cepat Candida albicans untuk spesimen  klinis. Dengan metode ini identifikasi positif Candida albicans dapat dilakukan setelah 24 sampai 48 jam inkubasi pada 37 ° C dalam 10% karbon dioksida dari feses, sekresi oral dan vaginal, dan kuku atau kerokan kulit. Vogel dan  Moses  mengkonfirmasi  keunggulan metode Weld untuk identifikasi yang relatif cepat untuk spesies  Candida albicans dalam dahak. Mereka menemukan bahwa penggunaan Eosin methylene blue agar  hanya dapat digunakan untuk metode yang lebih konvensional untuk identifikasi Candida albicans dalam dahak. Selain itu, dengan penambahan chlortetracycline hydrochloride  media menyediakan sarana untuk identifikasi beberapa jenis bakteri  Gram-negatif. Doupagne juga meneliti penggunaan media Levine dalam kondisi tropis.

Haley dan Stonerod  menemukan bahwa metode Weld adalah variabel sehingga Walker dan Huppert 14 menganjurkan penggunaan agar tepung jagung dan tes fermentasi cepat di samping media Levine. Dengan menggunakan teknik cepat gabungan mereka mampu mendapatkan hasil dalam waktu 48 sampai 72 jam. Setelah temuan Vogel dan Moses, Menolasino dan kawan-kawan menggunakan media Levine Eosin methylene blue agar  untuk identifikasi Staphylococcus koagulase-positif yang tumbuh dengan warna yang khas, dengan koloni titik yang tersebar. Media Levine lebih efisien jika dibandingkan dengan  media Tellurite Glisin Agar dan menunjukkan korelasi yang baik dengan tes koagulase plasma. (Thermo Fisher Scientific, 2013)

KARAKTERISTIK MEDIA EOSIN METHYLENE BLUE AGAR 

Media EMB Agar agar yang memiliki karakteristik sebagai berikut :

• Berdasarkan sifat fisiknya media EMB Agar merupakan media padat atau solid karena mengandung agar sekitar 15g /liter sehingga setelah dingin media akan menjadi padat. 
• Berdasarkan kandungan bahannya media EMB Agar merupakan media sintetis karena komposisinya tersusun dari bahan-bahan kimia yang telah diketahui komposisinya secara pasti. 
• Berdasarkan tujuan pembuatannya media EMB Agar merupakan media selektif diferensial untuk menubuhkan bakteri gram negatif dari golongan Enterobacteriaceae. 
• Media EMB Agar yang masih berupa serbuk memiliki warna ungu berbentuk serbuk dan media yang sudah jadi berwarna ungu gelap dengan konsistensi padat. 
• Berdasarkan jenisnya media EMB Agar merupakan media plate, karena dicetak di dalam petridisk steril. 
• Media EMB Agar memiliki pH asam yaitu pH 6.8 ± 0,2.

FUNGSI MEDIA EOSIN METHYLENE BLUE AGAR 

Secara umum media EMB agar adalah media isolasi untuk membedakan  bakteri Enterobacteriaceae. EMB Agar adalah media yang digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya bakteri coliform di dalam suatu sample. Media Eosin Methylene Blue Agar ini mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk membedakan mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam.  Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Fungsi dari eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan warna. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal, kuman lain bisa juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp. Hal ini dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Media ini berbentuk padat berguna untuk menjaga sel tidak berpindah tempat sehingga akan mudah dihitung dan dipisahkan jenisnya ketika tumbuh menjadi koloni. Media padat juga menampakkan difusi hasil metabolit bakteri sehingga memudahkan dalam pengujian suatu hasil metabolit.

KOMPONEN MEDIA EMB AGAR

Komposisi dari EMB Agar secara umum terdiri dari sumber nutrisi atau zat makanan dan komposisi media pertumbuhan. Salah satu media EMB Agar yang diproduksi oleh pabrik yang biasa digunakan di laboratorium adalah media EMB Agar dengan merk Oxoid CM0069, terdiri dari komponen :

Peptone                                   :  10.0 g/L

Lactose                                    :  10.0 g/L

Dipotassium hydrogen phosphate:  2.0 g/L

Eosin                                        :  0.4 g/L

Methylene blue                          :  0.065 g/L

Agar                                          :  15.0 g/L

FUNGSI KOMPONEN PENYUSUN MEDIA

Adapun fungsi dari masing-masing komponen tersebut adalah sebagai berikut :

Pepton 10 g

Peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. Sebagai sumber protein untuk mikroorganisme yang akan dibiakkan.

Lactose 10 g

Laktosa dan berfungsi untuk memisahkan bakteri yang memfermentasikan laktosa seperti E.coli, dengan bakteri yang tidak memfermentasi laktosa seperti S. aureus, Pseudomonas aeruginusae, dan Salmonella. Berfungsi sebagai sumber karbohidrat untuk pertumbuhan mikroorganisme.

Di-potassium hydrogen phosphate  21 g

Merupakan garam yang sangat larut dalam air. Bahan ini berfungsi sebagai pupuk, makanan aditif dan zat penyangga.

Eosin 0.4 g

Berfungsi sebagai indikator warna.

Methyline blue 0.06 g

Berfungsi sebagai Indikator warna. 

Agar 15 g

Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45⁰C.

PERHITUNGAN

Perhitungan dalam pembuatan media EMB Agar sangat diperlukan untuk membantu dalam penimbangan dan pelarutan media yang dibuat dengan volume tertentu. Penimbangan diperlukan agar komposisi media yang dibuat tepat, tidak berubah dan tetap dapat berfungsi baik dan sama walaupun dibuat dalam volume berbeda. Dalam kemasan media EMB Agar yang diproduksi oleh pabrik telah tertera standar penimbangan dan pelarutan media. Seperti pada media dehidrasi EMB Agar merk OXOID CM0069 standar penimbangan dan pelarutan yang diberikan  adalah 37, 5 gram dalam satu liter. Jika ingin membuat media dengan volume berbeda baik lebih besar maupun lebih sedikit dapat dikonversi menggunakan rumus sebagai berikut: V1/W1=V2/W2. Dengan V1  dan W1 merupakan volume dan berat dari standar penimbangan dan pelarutan yang diberikan oleh perusahaan yang memproduksi media, sedangkan V2 dan W2 merupakan volume pelarutan dan berat media yang akan ditimbang.

PENIMBANGAN

Penimbangan dilakukan dengan terlebih dahulu menyesuaikan dengan volume media yang ingin dibuat. Jika sudah ditentukan berapa besar volume media yang ingin dibuat, maka berat penimbangan dapat dihitung dengan perhitungan seperti di atas (V1/W1=V2/W2). 

PROSEDUR PEMBUATAN EMB AGAR

Media EMB Agar dapat dibuat melalui prosedur-prosedur sebagai berikut :

• Dipastikan semua alat dan bahan dalam keadaan siap digunakan. Semua APD digunakan dengan baik, benar, dan lengkap Disiapkan semua alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan. 
• Ditimbang serbuk media EMB agar (sesuai dengan volume yang dibuat) 
• Dipindahkan serbuk media EMB agar ke beaker glass, lalu ditambahkan aquadest sesuai dengan volume, dipindahkan ke Erlenmeyer. 
• Dihomogenkan larutan dengan bantuan pemanasan dan pengadukan. 
• Pelarutan tidak boleh sampai mendidih (pelarutan harus sempurna sehingga tidak ada kristal yang tersisa). 
• Dicek pH larutan sesuai petunjuk media (pH= 6,8 ± 0,2) pada suhu 250C. 
• Diperhatikan pengecekan suhu larutan saat pengecekan pH media. 
• Ditambah NaOH 0,01 N jika pH larutan kurang basa dan ditambahkan HCl 0,01 N jika pH larutan kurang asam. 
• Disterilisasi ±1210C (1 atm); ±15 menit. 
• Dibagi/ dimasukan kedalam petridisak steril yang sudah disiapkan. 
• Dibiarkan media membeku dengan sempurna. 
• Dimasukkan media ke inkubator (±370 C), ±24 jam untuk uji kualitas media, dengan posisi petridisk terbalik. 
• Disimpan pada suhu 40 C - 80 C untuk menyimpan media. 

(Merta, dkk., 2013)

UJI KUALITAS MEDIA

Kualitas media harus diperiksa terlebih dahulu sebelum media digunakan. Secara umum ada beberapa cara yang dapat dilakukan untuk menguji mutu media yang telah diuat, antara lain.

Secara visual

Secara visual dapat dilakukan dengan cara melihat warna, kekeruhan, dan perubahan lain yang dapat dilihat, contohnya :

Bila warna media EMB berubah warna dari warna standarnya yaitu ungu gelap. Jika hal ini terjadi patut dicurigai terjadi pergeseran nilai pH. Untuk itu dapat nilai pH dapat diukur kembali menggunakan alat ukur pH, seperti pH stik atau pH meter. Bila pH media berbeda ± 0,2 satuan , maka media harus dibuat baru, atau dapat pula ditambahkan larutan basa seperti NaOH jika kurang basa, atau larutan asam seperti HCl jika kurang asam.

Uji sterilitas

Uji sterilitas merupakan satu keharusan untuk mengetahui kualitas media apakah masih layak digunakan atau tidak. Uji sterilitas ini dilakukan dengan mengambil 5 % media dari setiap batch media yang dibuat. Kemudian diinkubasi selama dua hari pada suhu 350 C. Bila terdapat pertumbuhan lebih dari dua koloni kuman pada satu cawan petri atau lebih, berarti seluruh media dari batch tersebut tidak dapat dipakai.

Penanaman kuman kontrol positif dan kontrol negatif

Kuman kontrol positif adalah kuman yang seharusnya tumbuh pada media tertentu, sedangkan kontrol kuman negatif adalah kuman yang seharusnya tidak tumbuh pada media tertentu.

NILAI-NILAI KRITIS DALAM PEMBUATAN MADIA EMB AGAR ( EOSIN METHYLENE BLUE AGAR)

• Penimbangan bubuk media harus sesuai dengan volume yang akan dibuat, maka dari itu dapat dibantu dengan perhitungan. 
• Pelarutan media jangan sampai mendidih karena dapat merusak komposisi media, khususnya kandungan gula (laktosa), merubah pH media, dan membuat media susah memadat. 
• Pengecekan pH media harus pada suhu 25 °C agar tidak merusak indikator pH yang digunakan. 
• Proses sterilisasi harus tepat suhu, waktu dan tekanan pada autoklaf agar media yang dibuat terhindar dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. 
• Proses pengerjaan harus cepat dan tepat, khususnya saat media akan dituang ke petridisk, agar media tidak memadat sebelum dipindahkan ke petridisk. 
• Penuangan media ke petri disk harus pada kondisi steril yaitu melalui proses fiksasi. 
• Media diinkubasi selama ± 24 jam, dengan posisi petridisk terbalik, untuk menyediakan sirkulasi udara yang baik untuk pertumbuhan bakteri, dan agar uap air yang berkondensasi menjadi tetesan air tidak jatuh ke permukaan media dan menyebabkan kontaminasi. 
• Jika tidak digunakan media harus disimpan terhindar dari sinar matahari langsung dan disimpan di dalam kulkas pada suhu 20 – 80 C.

Daftar Pustaka

• Thrmo Fischer Scientific Inc. 2013. Dehydrated Culture Media EOSIN METHYLENE BLUE AGAR (MODIFIED) LEVIN Code: CM0069. Online. http://www.oxoid.com/UK/BLUE/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0069&c=UK&lang=EN (diakses 11 Juni 2013) 
• Merta, dkk. 2013. Penuntun Praktikum Pembuatan Media dan Reagensia. Denpasar : Kementerian Kesehatan republik Indonesia Politeknik Kesehatan Denpasar Jurusan Analis Kesehatan 
• Agus Krisno. 2011. Kebutuhan Dasar Nutrisi Mikroba. Oline. http:/aguskrisnoblog.wordpress.com/201112/29/.kebutuhan-dasar-nutrisi mikroba/. Diakses pada 13 Juni 2013. 
• John H. Thorngate iii, Seppo Salminen , Larry A . Branen , and Michael P . Davidson, ed. 2001). "Food Phosphates". Food Additives. CRC Press. Online.  Available : http://www.wikipedia.com. Diakses pada 13 Juni 2013