Media Blood Agar Plate (BAP)

Media Blood Agar merupakan media pertumbuhan bakteri yang dapat membedakan bakteri pathogen berdasarkan efek exotoksin hemolitik bakteri pada sel darah merah. Media Blood Agar bukan merupakan media selektif murni. Suatu media dikatakan media selektif apabila hanya ditumbuhi beberapa jenis mikroba sementara menghambat pertumbuhan mikroba jenis lain. Media Blood Agar adalah media yang diperkaya dengan nutrisi tambahan yang kaya untuk mikroba. Oleh karena itu, media Blood Agar merupakan media pertumbuhan diperkaya dan selektif diferensial, karena mendukung pertumbuhan berbagai organisme serta dapat memberi ciri yang khas untuk bakteri golongan tertentu.

Media BAP

Blood Agar Plate (BAP) merupakan media padat dan media diferensial. Media diferensial adalah media yang ditambah zat kimia tertentu sehingga suatu mikroorganisme membentuk pertumbuhan untuk mengklasifikasikan suatu kelompok jenis bakteri. Blood Agar Plate (BAP) membedakan bakteri hemolitik dan nonhemolitik yaitu berdasarkan kemampuan mereka untuk melisiskan sel-sel darah merah. Komposisi Blood Agar Plate (BAP) yaitu mengandung trypton 15 gram, soy peptone 5 gram, sodium khloride 5 gram, lithium khloride 10 gram, magnesium sulphate 3,8 gram, dan agar 15 gram.

Pada media Blood Agar biasa diinokulasikan sampel swab tenggorokan untuk mendeteksi keberadaan grup A Streptococcus hemolitik beta. Jenis yang pathogen adalah Streptococcus pyogenes, agen penyebab radang tenggorokan. Flora normal akan menunjukkan hemolisis alpha atau gamma. Untuk Blood Agar Base steril yang telah didinginkan sampai 45-50⁰C ditambahkan 5% v/v darah steril yang telah dihangatkan pada suhu kamar (Wakenko, 2011).

Ada tiga jenis hemolisis yaitu beta hemolisis, alfa hemolisis, dan gamma hemolisis. Beta hemolisis merupakan lisis lengkap sel darah merah dan hemoglobin. Alfa hemolisis mengacu pada lisis parsial/lisis sebagian dari sel darah merah dan hemoglobin. Hal ini menghasilkan perubahan warna disekitar menjadi abu-abu kehijauan. Gamma hemolisis yaitu tidak terjadi hemolisis dimana tidak ada perubahan warna dalam media.

Penampakan Hemolisis Pada Media BAP

ALAT DAN BAHAN

Alat

• Neraca analitik Sartorius\
• Petridish
• Jarum suntik
• Kapas
• Gunting
• Erlenmeyer
• Lampu Bunsen
• Gelas ukur
• Tabung reaksi
• Autoclave

Bahan

• Bubuk media Blood Agar Plate
• Aquades pH ± 7 (netral)
• pH stick
• Aluminium foil
• Benang
• Darah kambing/doba segar
• Alkohol

Pembuatan Media

• Alat dan bahan disiapkan.
• Bubuk media Blood Agar Base ditimbang sebanyak 40  gram kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca.
• Dilarutkan dengan 1000 ml aquades pH ± 7 (netral) kemudian dihomogenkan menggunakan stirrer magnetic
• Botol kaca yang berisi media ditutup dengan tutup botol yang dilapisi aluminum foil dan diikat dengan benang.
• Media disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121⁰C selama 15 menit.
• Media yang telah steril didinginkan hingga mencapai suhu 45-50⁰C.
• Ditambahkan 5-7% darah kambing
• Media dituang ke dalam plate dan ditunggu hingga padat.
• Setelah beku media siap digunakan

Pengambilan Darah kambing

• Alat dan bahan disiapkan
• Vena kambing dibersihkan dengan kapas alkohol. Bila perlu bulu-bulu kambing disekitar vena digunting agar vena terlihat dengan jelas
• Ditusuk vena dengan spuit dan diambil darah sesuai kebutuhan
• Dilepasan jarum dan segera diletakkan kapas alkohol 70% di atas bekas tusukan untuk menekan bagian tersebut selama 1-2 menit kemudian di plester.
• Darah kambing segar siap digunakan untuk pembuatan media

Media agar darah disebut media universal karena dapat digunakan untuk menumbuhkan beragam jenis bakteri. Media Agar Darah juga dapat membedakan bakteri hemolitik dan bakteri non hemolitik, yang ditandai oleh adanya zona (halo) disekitar koloni. Media untuk perkembangbiakan bakteri merupakan tempat untuk tumbuh dan berkembangnya suatu bakteri. Media tersebut biasanya berbentuk agar-agar. Dalam pembutan media untuk pertumbuhan bakteri diperlukan suatu kondisi yang steril, agar pada saat pembuatan media tidak ada bakteri yang tidak diinginkan ikut berkembang biak juga.

Media Blood Agar Plate merupakan media diperkaya. Disebut diperkaya karena media ini ditambahkan darah saat pembuatannya.Dimana darah yang bisa digunakan yaitu darah mamalia seperti domba, kuda dan manusia. Adapun kandungan-kandungan yang terdapat pada Blood Agar Base antara lain:

Lab ’Lamco’ Powder 10,0 g/L

Peptone 10,0 g/L

Sodium Chloride 5,0 g/L

Agar 15,0 g/L

Adapun hal-hal berikut yang perlu diperhatikan, yaitu:

Uji Kualitas Media

Untuk mengetahui kualitas media yang kita buat apakah memenuhi standar atau tidak, perlu melakukan beberapa uji kualitas media di antaranya :

• Uji secara visual: Uji ini digunakan untuk memperhatikan warna yang terlihat, contoh : warna media tidak sesuai dengan warna standar maka media dicurigai adanya perbedaan pH.
• Uji sterilitas: Uji ini merupakan suatu keharusan pada media yang diperkaya dengan bahan bahan terentu seperti darah agar. Cara untuk mengujinya  antara lain : Mengambil 5% media yang dibuat, diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37⁰ C, bila terdapat lebih dari 2 koloni kuman per cawan petri berarti media tidak dapat dipakai, karena sudah terkontamiinasi

Penyimpanan Media Blood Agar Plate

Media Blood Agar Plate dapat disimpan dengan memperhatikan hal-hal berikut:

• Hindari terkena cahaya matahari langsung.
• Media yang diperkaya dengan darah disimpan pada lemari es.
• Media dijaga agar tidak mengalami kekeringan. (untuk media di cawan petri sebaiknya menggunkan kantong plastic atau kertas san disimpan dalam lemri es).
• Media dengan cawan petri bisa bertahan selama kurang lebih 3 minggu 

Nilai-nilai Kritis Pembuatan Media Blood Agar Plate

• Alat-alat yang akan digunakan diberi label/etiket pembuatan
• Etiket pada media merupakan faktor penting yang harus diperhatikan untuk menghindari pemakaian media jika misalnya sudah kadaluwarsa.
• Penimbangan harus sesuai dengan volume yang dibuat
• Penambahan aquadest harus sesuai dengan volume agar media tidak terlalu encer ataupun terlalu cepat memadat
• Homogenisasi dengan pemanasan tidak boleh dilakukan sampai larutan media mendidih melainkan hanya sampai tidak ada kristal yang bersisa di dasar erlenmeyer
• Pengecekan pH dilakukan pada suhu 25^oC, nilai pH yang diharapkan adalah 7,3±0,2
• Apabila pH larutan terbukti kurang asam maka ditambahkan HCl 0,01 N dan apabila kurang basa perlu ditambahkan NaOH 0,01 N
• Larutan media disterilisasi autoclave pada suhu 121^oC selama 15 menit
• Darah domba ditambahkan setelah proses sterilisasi ± pada saat suhu larutan media 50^oC (pasca dikeluarkan dari autoclave) hal ini dilakukan mengingat darah domba yang ditambahkan dapat lisis dalam suhu  0yang terlalu tinggi (>50^oC)
• Darah yang ditambahkan tidak harus darah domba asalkan berasal dari makhluk berdarah panas
• Pada dasarnya darah domba memberikan hasil yang terbaik sebab eritrosit darah domba berukuran besar sehingga akan lebih mudah mengalami hemolisis
• Darah domba yang ditambahkan sebanyak 5% dari volume larutan media, patokan 5% karena dengan jumlah ini bakteri dapat menghemolisiskan darah dengan baik. Apabila darah yang ditambahkan lebih dari 5%, darah akan menutupi nutrien lain pada media. Namun, apabila darah yang ditambahkan kurang dari 5% maka bakteri tidak dapat menghemolisiskan darah
• Setelah ditambahkan darah, larutan media tidak boleh dipanaskan karena darah dapat rusak akibat teroksidasi
• Media diinkubasi dengan inkubator suhu 37^oC selama 24 jam
• Media saat itu diletakkan dengan posisi plate yang terbalik untuk  menghindari menetesnya uap air pada media yang dikhawatirkan akan mengurangi kualitas daripada media itu sendiri selain itu berfungsi pula untuk mempermudah pengambilan media
• Media setelah inkubasi sebaiknya tidak dibiarkan dalam lingkungan terbuka untuk menghindari kontaminasi mikroorganisme lain terutama jamur yang dapt menghambat pertumbuhan bakteri, media sebaiknya disimpan dalam kulkas yang mempunyai suhu konstan yakni 4^oC-8^OC.