Metode Analisis Karbohidrat

Metode Analisis Karbohidrat ada 2 jenis, yaitu:

-Analisis Kualitatif

-Analisis Kuantitatif

A. METODE ANALISIS KUALITATIF KARBOHIDRAT

1. Test Molish

Prinsip:

Karbohidrat akan didehidrasi oleh asam sulfat pekat membentuk senyawa furfural atau turunannya. Furfural dan turunannya akan berkondensasi dengan alfanaftol (molish) menghasilkan senyawa kompleks berwarna merah ungu pada bidang batas antara larutan karbohidrat dan H2SO4 pekat.

Cara Kerja :

• Sediakan tabung reaksi sebanyak 4 buah yang telah berisi label masing-masing sampel. 
• Tuang 5 ml masing-masing sampel ke tabung reaksi tadi. 
• Tambahkan 2 tetes pereaksi Molish ke masing-masing sampel. 
• Tambahkan 3 ml H2SO4 pekat ke masing-masing sampel secara  berhati-hati melalui dinding tabung. 
• Amati perubahan yang terjadi.

2. Test Moore

Prinsip:

Uji Moore menggunakan NaOH (alkali) yang berfungsi sebagai ion OH- yang akan berikatan dengan rantai aldehid yang membentuk aldol aldehid (aldehida dengan cabang gugus alkanol) yang berwarna kekuningan. Pemanasan bertujuan untuk membuka ikatan karbon dengan hydrogen dan menggantikannya dengan gugus –OH.

Cara Kerja :

• Siapkan 4 tabung reaksi yang telah berisi label masing-masing    sampel. 
• Masukkan sampel ke tabung sesuai dengan labelnya sebanyak 5 ml. 
• Isi masing-masing tabung dengan 1 ml NaOH. 
• Panaskan kedalam panic yang telah berisi air mendidih. 
• Tunggu selama 5 menit kemudian angkat. 
• Amati perubahan yang terjadi.

3. Test Benedict

Prinsip:

Larutan CuSO4 dalam suasana alkali akan direduksi oleh gula yang mempunyai gugus aldehid sehingga CuO atau kupri tereduksi menjadi Cu2O yang berwarna merah bata (endapan).

Cara Kerja :

• Siapkan 4 tabung reaksi yang telah berisi label masing-masing sampel. 
• Tuang 5 ml larutan Benedict ke masing-masing tabung reaksi yang telah berisi sampel tadi. 
• Tambahkan 1 ml sampel ke masing-masing tabung reaksi tersebut. 
• Panaskan selama 3 sampai 5 menit, kemudian angkat. 
• Amati perubahan yang terjadi.

4. Test Selliwanof

Prinsip:

Perubahan fruktosa oleh HCl panas menjadi levulinat dan hidroksimetil furfural, selanjutnya kondensasi hidroksimetil dengan resorsinol akaan menghasilkan senyawa sukrosa yang mudah dihidrolisa menjadi glukosa akan member reaksi positif berwarna oranye.

Cara Kerja :

• Siapkan 4 tabung reaksi yang telah berisi label masing-masing sampel. 
• Tambahkan 5 ml larutan Selliwanof ke masing-masing tabung yang telah berisi sampel tadi. 
• Tuangkan 1 ml sampel ke masing-masing sampel sesuai dengan labelnya. 
• Panaskan selama 3 sampai 5 menit, kemudian angkat. 
• Amati perubahan yang terjadi.              

5. Test Barfoed

Prinsip:

Monosakarida akan mereduksi Cu2+ dalam suasana asam lemah (CH3COOH), menghasilkan endapan yang berwarna merah bata dari Cu2O.

Cara Kerja :

• Sediakan 4 tabung reaksi yang telah berisi label masing-masing sampel. 
• Tambahkan 5 ml larutan Barfoed ke masing-masing tabung reaksi yang telah berisi sampel tadi. 
• Tuangkan 1 ml larutan sampel ke masing-masing tabung sesuai dengan label. 
• Panaskan selama 3 sampai 5 menit, kemudian angkat. 
• Amati perubahan yang terjadi

6. Metode Fehling

Prinsip dari metode fehling yaitu menggunakan gugus aldehid pada gula untuk mereduksi senyawa Cu2SO4 menjadi Cu2O (enpadan berwarna merah bata) setelah dipanaskan pada suasana basa (Benedict dan Fehling) atau asam (Barfoed) dengan ditambahkan agen pengikat (chelating agent) seperti Na-sitrat dan K-Na-tatrat.

Cara Kerja:

• Disiapkan pada tabung reaksi masing-masing 2 ml larutan 0.5% glukosa, 1.0% glukosa, dan 2.0% glukosa. 
• Disiapkan larutan fehling (6 ml), mencampurkan antara Fehling A (3 ml) dan Fehling B (3 ml) dengan volume yang sama. 
• Memasukkan 2 ml larutan Fehling kedalam masing-masing tabung reaksi, kocok dan panaskan dengan air mendidih. 
• Mengamati perubahan (warna) yamg terjadi pada masing-masing tabung reaksi. 
• Memasukkan sepotong irisan tipis dari pisang mantah kedalam tabung reaksi, dan sepotong irisan tipis dari pisang yang telah masak sempurna kedalam tabung reaksi lain. 
• Menghancurkan irisan tipis pisang tersebut, dan tambahkan 2 ml larutan Fehling kedalam tabung reaksi

7. Metode Osazon

Prinsip:

Reaksi ini dapat digunakan baik untuk larutan aldosa maupun ketosa, yaitu dengan menambahkan larutan fenilhidrazin, lalu dipanaskan hingga terbentuk kristal berwarna kuning yang dinamakan hidrazon (osazon).

Cara Kerja:

• Campurkan fenil hidrazin Na asetat kering dengan 5 ml larutan percobaan. 
• Kocok dan panaskan di dalam penangas air, kemudian didinginkan 
• Periksa endapan dibawah mikroskop. Larutan yang diuji adalah larutan glukosa 1%, fruktosa 1%, sukrosa 1%, laktosa 1%, maltosa 1%, pati 2%.

8. Metode Tollens

Prinsip:

Tollen terdiri dari Ag2SO4 yang bila ada gula pereduksi Ag akan direduksi menjadi Ag+ yang akan membentuk cinci perak. Kelemahan dari reaksi Tollen adalah dia bukan cuma bereaksi dengan gula pereduksi tetapi juga bereaksi dengan senyawa keton yang mempunyai gugus metil.

Cara Kerja:

• 1 ml larutan AgNO3 di campurkan kemudian 2 tetes NaOH 10% ( ditetes demi tetes) dan ammonia encer. 
• Campuran di atas di aduk kemudian di tambahkan 1 ml larutan sampel ( karbohidrat) didiamkan selama 5 menit. 
• Jika tidak terjadi reaksi larutan di panaskan. 
• Pada semua larutan smapel di lakukan hal yang sama 
• Hasil pengamatan di catat.

     9. Metode iodine

Prinsip:

Uji iodium digunakan untuk melihat pembentukan polisakarida. Penambahan iodium pada suatu polisakarida akan menyebabkan terbentuknya kompleks absorbsi berwarna spesifik. Amilum atau pati akan menghasilkan warna biru. Hasil yang postif hanya pada penambahan air dan HCl dengan iodine.

Cara Kerja:

• Di tambahkan 2 tetes iodine pada 3 ml pada masing-masing larutan karbohidrat (Larutan Glukosa, Larutan Fruktosa, Larutan Maltosa, Larutan Laktosa, Larutan Amilum, Larutan Gula, Larutan Madu, dan Larutan Susu), pada tabung reaksi I ditambahkan 2 tetes air, pada tabung reaksi II di tambahkan 2 tetes HCL 6 N, dan pada tabung reaksi III di tambahkan 2 tetes NaOH 6 N. 
• Hasil campuran diatas di kocok dan di perhatikan warna apa yang terbentuk. 
• Setelah di kocok tabung di panaskan, dan kemudian di dinginkan. 
• Di lakukan hal yang sama pada semua larutan sampel. 
• Hasil pengamatan di catat.

B. METODE ANALISIS KUANTITATIF KARBOHIDRAT

Ada beberapa macam metode yang dapat kita gunakan untuk analisa kadar gula reduksi secara    kuantitatif yaitu :

1. Metode Fisika

Ada dua (2) macam, yaitu :

a. Berdasarkan indeks bias

Cara ini menggunakan alat yang dinamakan refraktometer, Refraktometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur kadar/ konsentrasi bahan terlarut. Misalnya gula, garam, protein, dsb. Prinsip kerja dari refraktometer sesuai dengan namanya adalah memanfaatkan refraksi cahaya. Refraktometer ditemukan oleh Dr. Ernest Abbe seorang ilmuan dari German pada permulaan abad 20 (Anonim, 2010). Pengukurannya didasarkan atas prinsip bahwa cahaya yang masuk melalui prisma-cahaya hanya bisa melewati bidang batas antara cairan dan prisma kerja dengan suatu sudut yang terletak dalam batas-batas tertentu yang ditentukan oleh sudut batas antara cairan dan alas.

yaitu dengan rumus :
X = [(A+B)C - BD)]
dimana :
X = % sukrosa atau gula yang diperoleh
A = berat larutan sampel (g)
B = berat larutan pengencer (g)
C = % sukrosa dalam camp A dan B dalam tabel
D = % sukrosa dalam pengencer B –

Cara Kerja:

• Refraktometer dibersihkan terlebih dahulu dengan tisu ke arah bawah 
• Refraktometer ditetesi dengan  aquadest atau larutan NaCl 5% pada bagian prisma dan day light plate 
• Refraktometer dibersihkan dengan kertas tissue sisa aquadest / NaCl yang tertinggal 
• Sampel  cairan diteteskan pada prisma 1 – 3 tetes 
• Skala kemudian dilihat ditempat yang bercahaya dan dibaca skalanya 
• Kaca dan prisma dibilas dengan aquades / NaCl 5% serta dikeringkan dengan tisu, dan 
• Refraktometer disimpan di tempat kering

b. Berdasarkan rotasi optis

Cara ini digunakan berdasarkan sifat optis dari gula yang memiliki struktur asimetrs (dapat memutar bidang polarisasi) sehingga dapat diukur menggunakan alat yang dinamakan polarimeter atau polarimeter digital (dapat diketahui hasilnya langsung) yang dinamakan sakarimeter. Menurut hokum Biot; “besarnya rotasi optis tiap individu gula sebanding dengan konsentrasi larutan dan tebal cairan” sehingga dapat dihitung menggunakan rumus :
[a] D20 = 100 A
L x C
[a] D20 = rotasi jenis pada suhu 20 oC menggunakan
D = sinar kuning pada panjang gelombang 589 nm dari lampu Na
A = sudut putar yang diamati
C = kadar (dalam g/100 ml)
L = panjang tabung (dm)
sehingga C = 100 A
L x [a] D20

2. Metode Kimia

Metode ini didasarkan pada sifat mereduksi gula, seperti glukosa, galaktosa, dan fruktosa (kecuali sukrosa karena tidak memiliki gugus aldehid). Fruktosa meskipun tidak memiliki gugus aldehid, namun memiliki gugus alfa hidroksi keton, sehingga tetap dapat bereaksi. Dalam metode kimia ini ada dua (2) macam cara yaitu :

Titrasi
Untuk cara yang pertama ini dapat melihat metode yang telah distandarisasi oleh BSN yaitu pada SNI cara uji makanan dan minuman nomor SNI 01-2892-1992.

Spektrofotometri
Adapun untuk cara yang kedua ini menggunakan prinsip reaksi reduksi CuSO4 oleh gugus karbonil pada gula reduksi yang setelah dipanaskan terbentuk endapan kupru oksida (Cu2O) kemudian ditambahkan Na-sitrat dan Na-tatrat serta asam fosfomolibdat sehingga terbentuk suatu komplek senyawa berwarna biru yang dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm. 

Cara Luff Schoorl

Prinsip: Monosakarida dioksidasi oleh CuO dari reagen Luff Schoorl menjadi Cu2O.kemudian kelebihan CuO dari reagen luff Schoorl akan bereaksi dengan KI suasana asam membentuk I2 yang akan bereaksi dengan cara dititrasi dengan Na-tiosulfat dengan indikator amilum .

Cara Kerja:

Persiapan Sampel
Pada prosedur kerja dalam praktikum ini, sampel yang ingin dilakukan pengujian telah tersedia sehingga dalam praktikum ini kami tidak melakukan proses persiapan sampel. 

Prosedur Kerja Analisa
Berikut prosedur kerja pengujiannya:

• Pipet sample sebanyak 5 ml ke dalam erlenmeyer kemudian tambahkan 35 ml aquades dan 10 ml larutan luff. 
• Panaskan sampai mendidih 
• Dinginkan dalam wadah berisi air. 
• Tambahkan 10 ml larutan KI 25% dan 17 ml H2SO4 6N perlahan-lahan lewat dinding. 
• Tambahkan 2 ml amilum, amati perubahan warna yang terjadi (biru tua). 
• Titrasi dengan larutan Natrium tiosulfat 0,005N sampai warna biru tua hilang. 
• Catat volume titrasi. 

3. Metode Nelson-Somogyi

Metode ini dapat digunakan untuk mengukur kadar gula reduksi dengan menggunakan pereaksi tembaga arseno molibdat. Kupri mula-mula direduksi menjadi bentuk kupro dengan pemanasan larutan gula. Kupro yang terbentuk selanjutnya dilarutkan dengan arseno molibdat menjadi molibdenum berwarna biru yang menunjukkan ukuran konsentrasi gula dan membandingkannya dengan larutan standar sehingga konsentrasi gula dalam sampel dapat ditentukan. Reaksi warna yang terbentuk dapat menentukan konsentrasi gula dalam sampel dengan mengukur absorbansinya. (Sudarmadji.S.1984)

Cara Kerja :

• Diambil 1 ml larutan sampel. 
• Ditambahkan 1 ml reagen Nelson pada tiap-tiap tabung reaksi dan dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit, kemudian didinginkan 5 menit dalam air mengalir. 
• Ditambahkan 1 ml reagen arsenomolibdat pada tiap-tiap tabung reaksi, dikocok sampai homogen  dan larut sempurna. 
• Ditambahkan 7 ml aquadest pada tiap-tiap tabung reaksi, kemudian dikocok. 
• Ukur absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. 
• Kadar gula reduksi sampel ditentukan dengan menggunakan persamaan kurva standard.

4. Metode enzimatis

Untuk metode enzimatis ini, sangat tepat digunakan untuk penentuan kagar suatu gula secara individual, disebabkan kerja enzim yang sangat spesifik. Contoh enzim yang dapat digunakan ialah glukosa oksidase dan heksokinase Keduanya digunakan untuk mengukur kadar glukosa.

Glukosa oksidase
D- Glukosa + O2 oleh glukosa oksidase à Asam glukonat dan H2O2
H2O2 + O-disianidin oleh enzim peroksidase à 2H2O + O-disianidin teroksdasi yang berwarna cokelat (dapat diukur pada l 540 nm).

Heksokinase
D-Glukosa + ATP oleh heksokinase à Glukosa-6-Phospat +ADP
Glukosa-6-Phospat + NADP+ oleh glukosa-6-phospat dehidrogenase à Glukonat-6-Phospat + NADPH + H+ Adanya NADPH yang dapat berpendar (memiliki gugus kromofor) dapat diukur pada l 334 nm dimana jumlah NADPH yang terbentuk setara dengan jumlah glukosa.

Menggunakan enzim spesifik untuk karbohidrat yan g akan diuji. Contoh enzimnya yaitu    glukosa oksidase dan heksokinase.

5. Metode Dinitrosalisilat (DNS)

Prinsip:

Metode ini digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik kolorimetri. Teknik ini hanya dapat mendeteksi satu gula pereduksi, misalnya glukosa. Glukosa memiliki gugus aldehida, sehingga dapat dioksidasi menjadi gugus karboksil. Gugus aldehida yang dimiliki oleh glukosa akan dioksidasi oleh asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi gugus karboksil dan menghasilkan asam 3-amino-5-salisilat pada kondisi basa dengan suhu 90-100oC. Senyawa ini dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.

Cara membuat pereaksi DNS  :

• Sebanyak 5 g asam 3,5-dinitrosalisilat dan 5 g NaOH 2 N dilarutkan dalam 100 mL aquades (larutan A). 
• Sebanyak 150 g natrium kalium tartarat dilarutkan dalam 200 mL aquades (larutan B). Larutan A dan B dicampur, lalu ditera dalam labu takar dengan aquades hingga volume akhirnya menjadi 500 mL, kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik selama satu malam.

Cara kerja :

• Buat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing 0, 200, 400, 800, 1200, 1600, dan 2000 ppm. 
• Masing-masing larutan diambil 1 mL, lalu tambahkan 3 mL pereaksi DNS. 
• Kemudian, masing-masing larutan divorteks dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. 
• Setelah dingin, masing-masing larutan diencerkan 5 kali dan divorteks kembali. 
• Ukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm, kemudian buat persamaan liniernya sebagai kurva standar. 
• Pengukuran kadar gula pereduksi pada sampel dilakukan dengan cara mengambil 1 mL sampel kemudian ditambahkan 3 mL pereaksi DNS. 
• Proses selanjutnya sama seperti pada larutan glukosa standar, kemudian nilai pengukuran yang diperoleh diplot pada kurva standar.

6. Metode Asam Fenol Sulfat

Prinsip:

Metode ini disebut juga dengan metode TS (total sugar) yang digunakan untuk mengukur total gula. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula pereduksi. Gula sederhana, oligosakarida, dan turunannya dapat dideteksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat yang akan menghasilkan warna jingga kekuningan yang stabil.

Cara Kerja:

• Buat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing 0, 100, 200, 300, 400, dan 500 ppm. 
• Masukkan 0,5 mL dari masing-masing larutan ke dalam tabung yang terpisah, kemudian rendam dalam air, lalu tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan 2,5 mL H2SO4 pekat dengan hati-hati melalui dinding tabung. 
• Biarkan selama 10 menit, lalu vorteks dan biarkan kembali selama 20 menit.  
• Ukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm, kemudian buat persamaan liniernya sebagai kurva standar. 
• Pengukuran sampel dilakukan dengan cara memasukkan 0,5 mL larutan sampel ke dalam tabung, lalu rendam dalam air, kemudian tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan 2,5 mL H2SO4 secara hati-hati. 
• Proses selanjutnya sama seperti pada larutan glukosa standar, kemudian nilai pengukuran yang diperoleh diplot pada kurva standar.

Sumber:

• Achmad, M dan Abdul, R.(Editor), 2006,Pengantar Kimia Farmasi Analisis :              Volumetri dan Gravimeteri, Pustaka Pelajar, Yogyakarta. 
• Sumantri, AbdulR,2007,Analisis Makanan,Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
• PutriPuspita.2013.UjiKuantitatifKarbohidrat.online:http://organiksmakma3a26.blogspot.com/2013/03/uji-kuantitatif-karbohidrat.html (diakses tanggal 10 Maret 2014).
• Rosnah, dkk. 2011. Pedoman Praktikum Ilmu Kimia Makanan. Kendari: Politeknik Kesehatan Kendari Jurusan Gizi
• Winarno. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama