Tes Tubex TF

Tubex TF adalah suatu tes diagnostic in vitro semi kuantitatif untuk deteksi Demam Tifoid akut yang disebabkan oleh salmonella typhi, melalui deteksi spesifik adanya serum antibodi lgM tersebut dalam menghambat (inhibasi) reaksi antara antigen berlabel partikel lateks magnetik (reagen warna coklat) dan monoklonal antibodi berlabel lateks warna (reagen warna biru), selanjutnya ikatan inhibasi tersebut diseparasikan oleh suatu daya magnetik. Tingkat inhibasi yang dihasilkan adalah setara dengan konsentrasi antibodi lgM S. Typhi dalam sampel. Hasil dibaca secara visual dengan membandingkan warna akhir reaksi terhadap skala warna.

TUBEX merupakan alat diagnostik demam tifoid yang diperoduksi oleh IDL Biotech, Sollentuna, Sweden. Tes ini sangat cepat 5-10 min, simpel, dan akurat. Tes TUBEX ini menggunakan sistem pemeriksaan yang unik dimana tes ini mendeteksi serum antibody immunoglobulin M (Ig M) terhadap antigen O9 (LPS) yang sangat spesifik terhadap bakteri salmonella typhi. Metode dari tes TUBEX ini adalah mendeteksi antibody melalui kemampuannya untuk memblok ikatan antara reagent monoclonal anti-O9 s.typhi (antibody-coated indicator particle) dengan reagent antigen O9 s.typhi (antigen-coated magnetic particle) sehingga terjadi pengendapan dan pada akhirnya tidak terjadi perubahan warna.

Secara imunologi, antigen O9 bersifat imunodominan. Antigen ini dapat merangsang respons imun secara independen terhadap timus, pada bayi, dan merangsang mitosis sel B tanpa bantuan dari sel T. Karena sifat-sifat ini, respon terhadap antigen O9 berlangsung cepat sehingga deteksi terhadap anti-O9 dapat dilakukan lebih dini, yaitu pada hari ke 4-5 untuk infeksi primer dan hari ke 2-3 untuk infeksi sekunder.

Dasar konsep antibodi lgM spesifik terhadap salmonella typhi digunakan sebagai marker penanda TUBEX TF menurut beberapa peneliti: kadar ketiga kelas immunoglobin anti Lipopolisakarida (lgA, lgG dan lgM) lebih tinggi pada pasien tifoid dibandingkan kontirol;pengujian lgM antipolisakarida memberikan hasil yang berbeda bermakna antara tifoid dan non tifoid.

Dalam diagnosis serologis Demam Tifoid, deteksi antibodi lgM adalah lebih baik karena tidak hanya meningkat lebih awal tetapi juga lebih cepat menurun sesuai dengan fase akut infeksi, sedangkan antibodi lgG tetap bertahan pada fase penyembuhan. TUBEX TF mendeteksi antibodi lgM dan bukan lgG. Hal ini membuat sangat bernilai dalam menunjang diagnosa akut.

Prinsip kerja dari tes TUBEX adalah sebagai berikut yaitu ketika partikel magnet yang diselimuti oleh antigen (s.typhi LPS) dicampurkan dengan blue latex antibody-coated indicator particle yang diselimuti oleh anti-s typhi LPS (O9) antibody, maka kedua jenis partikel ini akan berikatan satu dengan yang lain. Ketika pada akhir eksperimen tabung berbentuk V tempat terjadinya proses reaksi diatas diletakan diatas magnet stand, maka antigen-coated magnetic particle akan tersedimentasi dibawa tabung. Begitu juga blue latek particle yang telah berikatan dengan antigen-coated magnetic particle akan ikut tersedimentasi pada bagian bawah tabung. Sehingga terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah. Hal ini menunjukan tidak adanya anti-s typhi O9 antibody pada serum milik pasien dan hasil reaksi dikatakan negative (pasien tidak terindikasi menderita demam tifoid).

Prinsip dari tes TUBEX.
Sebelah kiri, negative result; sebelah kanan, positive result ( Lim, et al, 1998)

Seperti yang telah disinggung diatas bahwa kini tes TUBEX tidak hanya mendeteksi adanya antibody anti-O9 spesifik s.typhi saja, melainkan juga dapat mendeteksi antigen O9 spesifik s.typhi. Hal ini membuat TUBEX menjadi sangat unik karena kemampuannya untuk mendeteksi baik antibody maupun antigen. Secara teoritis hal ini sangatlah penting untuk dignostik serologi pada fase akut. Mengingat bahwa secara teori antigenlah yang terlebih dahulu muncul daripada antibody diawal mulainya terjadi infeksi. Sangatlah penting untuk mengambil sampel serum pada hari-hari awal saat onset panas mulai muncul. Mengingat pada saat itulah antigen banyak terdapat pada serum pasien, jika telat dilakukan pengambilan sampel maka antigen didalam serum akan menghilang karena terjadinya ikatan terhadap antibody yang terbentuk dan selanjutnya membentuk antibody-antigen komplek.

Urine memberikan hasil yang lebih menjanjikan daripada serum dalam mendeteksi antigen, dikarenakan antigen sangat cepat hilang didalam sirkulasi. Sebaliknya antigen secara berkesinambungan diekskresikan melalui urin sebagai free antigen. Keuntungan lain menggunakan urine adalah konsentrasi antigen dapat ditingkatkan beberapa kali lipat dengan cara yang sederhana. Metode yang digunakan adalah sama dengan tes TUBEX yang asli yaitu memblok ikatan antara reagent anti-O9 s.typhi (antibody-coated indicator particle) dengan reagent antigen O9 s.typhi (antigen-coated magnetic particle), tetapi yang berperan memblok disini adalah antigen (lihat gambar 5). Protokol kerja utuk mendeteksi antigen pun sama dengan protokol kerja untuk mendeteksi antibody, hanya saja serum specimen terlebih dahulu dicampurkan dengan blue reagent dan dicampur dalam 2 menit, barulah setelah itu ditambahkan brown reagent. Proses selajutnya dan pembacaan hasilnya menggunakan cara yang sama.

Ilustrasi bagaimana kerja tes TUBEX dalam mendeteksi anti-O9 antibody
atau mendeteksi antigen O9 s.typhi (Tam, et al, 2008)

Untuk menilai pengaruh efek dari pendeteksian antigen terhadap sensitivitas dan spesifisitas dari uji TUBEX, telah dilakukan penelitian oleh Tam, et al, 2008. Ia membandingkan antara protokol asli untuk mendeteksi antibody dan protokol baru untuk mendeteksi antigen. Ia menggunakan beberapa level antigen yang dicampurkan pada serum sempel. Hal yang didapatkan adalah peningkatan sensitivitas sebanyak 2-4 kali lipat

Diagram perbandingan tes TUBEX.
Menujukan bahwa protokol baru antigen detection memberikan hasil yang lebih tinggi pada TUBEX score pada kadar antigen serum yang sama (Tam, et al, 2008)

Pemeriksaan ini dilakukan dengan menggunakan 3 macam komponen, meliputi:

• Tabung berbentuk V, yang juga berfungsi untuk meningkatkan sensitivitas.
• Reagen A (brown), yang mengandung partikel magnetik yang diselubungi dengan antigen S. typhi O9
• Reagen B (blue), yang mengandung partikel lateks berwarna biru yang diselubungi dengan antibodi monoklonal spesifik untuk antigen 09.

Komponen-komponen ini stabil disimpan selama 1 tahun dalam suhu 40C dan selama beberapa minggu dalam suhu kamar.

Adapun alat dan bahan yang dibutuhkan untuk melakukan tes Tubex TF yaitu:

- Alat

• Mikropipet (40 dan 90 µl)
• Yellow tip

- Bahan

• Sampel serum
• Tubex TF reagen
• Reagen biru
• Reagen coklat
• Kontrol positif dan negative
• Skala warna strip wall reaction
• Tape sealing

Cara Kerja Tes Tubex TF:

• Masukkan 45 µl antigen coated magnetic particle (brown reagent) pada reaction caontainer yang disediakan (satu set yang terdiri dari enam tabung berbentuk V). Reagen dimasukkan ke sumur 1,2 dan 3.
• Masukan 45µl serum sampel (serum harus jernih) ke dalam sumur yang sudah berisi reagen, lalu campurkan keduanya dengan menggunakan pipette tip.
• Inkubasi dalam 2 menit.
• Tambahan 90 µl antibody coated indikator partikel (blue reagent)
• Tutup tempat reaksi tersebut dengan menggunakan strip, lalu ubah posisi tabung dari vertical menjadi horizontal dengan sudut 90º.
• Goyang-goyangkan tabung kedepan dan kebelakang selama 2 menit.
• Pada akhir proses reaksi ini tabung berbentuk V ini diletakkan diatas magnet stand.
• Didiamkan 5 menit untuk terjadi proses pemisahan (pengendapan).
• Pembacaan skor hasil dari reaksi ini dilakukan dengan cara mencocokkan warna yang terbentuk pada akhir reaksi dengan skor yang tertera pada color scale.

Interpretasi Hasil:

≤ 2       : Negatif (tidak menunjukkan indikasi demam tifoid)

3          : Border line skor (tidak meyakinkan, analisis perlu diulang)

4          : Positif lemah (indikasi demam tifoid)

6-10     : Positif kuat (indikasi kuat demam tifoid)

Konsep pemeriksaan ini dapat diterangkan sebagai berikut. Ketika partikel magnet yang diselimuti oleh antigen (s.typhi LPS) dicampurkan dengan blue latex antibody-coated indicator particle yang diselimuti oleh anti-s typhi LPS (O9) antibody, maka kedua jenis partikel ini akan berikatan satu dengan yang lain. Ketika pada akhir eksperimen tabung berbentuk V tempat terjadinya proses reaksi diatas diletakan diatas magnet stand, maka antigen-coated magnetic particle akan tersedimentasi dibawa tabung. Begitu juga blue latek particle yang telah berikatan dengan antigen-coated magnetic particle akan ikut tersedimentasi pada bagian bawah tabung. Sehingga terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah. Hal ini menunjukan tidak adanya anti-s typhi O9 antibody pada serum milik pasien dan hasil reaksi dikatakan negative (pasien tidak terindikasi menderita demam tifoid). Hasil tes TUBEX akan bernilai positive (pasien terindikasi menderita penyakit demam tifoid) apabila tidak terjadi perubahan warna (tetap berwarna biru). Hal ini menunjukan terdapatnya anti-s typhi O9 antibody yang mampu menghambat ikatan antara antigen-coated magnetic particle dengan blue latex antibody-coated indicator particle (lihat gambar 3, sebelah kanan). Sehingga pada akhir reaksi blue latex particle tidak ikut tersedimentasi pada dasar tabung, sehingga warna tabung tetap berwarna biru.

Perubahan Warna Pada Hasil Tes Tubex Negatif dan Positif

Jika dibandingakan antara tes TUBEX dengan uji Widal akan ditemukan beberapa hal sebagai berikut:

• Antigen yang digunakan pada tes TUBEX adalah anti-O9 s.typhi yang mampu membedakan organisme ini dari >99% serotype bakteri salmonella lainnya, sedangkan uji Widal menggunakan antigen yang tidak begitu spesifik terhadap s.typhi sehingga dapat terjadi cross-reaction dengan kuman salmonella lainnya misalnya pada pasien yang pernah menderita enteric fever lainnya. Reaksi ini dinamakan anamnestic response dan dapat menimbulkan tingginya nilai false positive. Hal ini menjawab alasan dari kurang spesifiknya uji Widal.
• Dilihat dari metode yang digunakan oleh kedua tes, dimana TUBEX menggunakan kemampuan inhibitor activities dari antibody dan uji Widal menggunakan reaksi agglutinasi. Inhibitor activities memiliki keuntungan karena lebih mudah dideteksi walaupun dengan kadar antibody yang rendah. Hal ini memberikan alasan mengapa TUBEX lebih sensitive daripada uji Widal.
• Single test pada uji Widal tidak begitu bermakna. Idealnya uji widal dilakukan dua kali yaitu pada fase akut dan 7-10 hari setelahnya. Hal ini dikarenakan agglutinin O dan H meningkat dengan tajam ±8 hari setelah onset panas pertama. Jika terjadi empat kali peningkatan titer agglutinin baru dapat dikatakan hasilnya positive secara signifikan. Sayangnya hal ini jarang ditemukan karena penggunaan antibiotik pada awal penyakit bisa mencegah meningkatnya titer agglutinin. Hal ini berbeda dengan tes TUBEX yang fokus mendeteksi Ig M yang secara teoritis muncul lebih awal daripada Ig G. Bahkan penelitian terbaru mengatakan bahwa tes TUBEX yang dimodifikasi mampu mendeteksi bukan hanya antibody melainkan antigen s.typhi , sehingga tes ini sangat berguna pada fase akut. Hal ini menyebabkan tingginya angka sensitivitas tes TUBEX.
• Meningkatnya penggunaan vaksin typhoid menyebabkan meningkatnya angka false positive pada uji Widal. Hal ini terjadi karena meninggkatnya agglutinin level secara persisten pada H agglutinin dan transient pada O agglutinin, yang terjadi baik pada non-infected population maupun pada febrile non-typhoid patients karena anamnestic response. Hal ini belum pernah dilaporkan pada pemeriksaan dengan menggunakan tes TUBEX. Tentu saja ini sangat berpengaruh pada penggunaan antibiotik yang tidak tepat dan meningkatkan angka resistensi obat. Untungnya hal ini dapat diatasi dengan mengulangi tes Widal pada minggu berikutnya, karena tidak akan terjadi peninggkatan lagi pada hasil tes ulangan tersebut.
• Sensitivitas dan spesifistas yang cukup berbeda, pada suatu penelitain oleh Olsen, Sonja et al, 2004 menyebutkan perbedaan antara tes TUBEX dan uji Widal yaitu; sensitivitas (78/64); spesifisitas (94/76); positive predictive value (98/88); dan negative predictive value (59/43). beberapa penelitian lain menunjukan sensitivitas dan spesifisitas TUBEX yang lebih tinggi lagi yaitu 94,7% dan 80,4%-93%.
• Harga TUBEX ±4 U.S dollar dan Widal 0,5 U.S dollar, harga ini dilihat dari penelitian di Vietnam, akan tetapi harga ini belum termasuk biaya transportasi.
• Persamaan yang dimiliki oleh kedua tes ini dan sangatlah penting adalah proses pengerjaan yang relatif mudah; simpel (one-step); tidak membutuhkan alat-alat canggih dan mahal, sehingga kedua tes ini dapat diterapkan pada daerah edemik yang cenderung merupakan negara berkembang.
• Masih banyak lagi kelemahan uji widal seperti nilai dari uji ini yang sangat dipengaruhi oleh operator yang bekerja dll. Beberapa hal diatas menunjukan bahwa tes TUBEX dapat menutupi kelemahan dari uji Widal dan memiliki keunggulan dari tes Widal.

Kinerja Tubex TF dibandingkan dengan Widal

DAFTAR PUSTAKA

Afifi, Salma, et al. Hospital-Based Surveillance for Acute Febrile Illness in Egypt: A Focus on Community-Acquired Bloodstream Infections.  Am. J. Trop. Med. Hyg. 2005:73(2):392-399.

Dimitrov, Tsonyo. Clinical and Microbiological Investigation of Typhoid Fever in an Infectious Disease Hospital in Kuwait.  Journal of Medical Microbiology. 2007:56:538-544.

Kelly-Hope, Louise A, et al. Geographical Distribution and Risk Factor Associeted with Enteric Disease in Vietnam. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2007:76(4):706-712.

Olsen, Sonja J, et al. Evaluation of Rapid Diagnostic Tests for Typhoid Fever. Journal of Medical Microbiology. 2004:1885-1889.

Parry, M Christopher, et al. A Rivew of Thyphoid Fever. N Engl J Med. Vol. 347. 2002: 22;1770-1782.

Willke, Ayse. Widal Test in Diagnosis of Typhoid Fever in Turkey.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2002:938-941.